常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類,一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)染)。前者外源 DNA /RNA不整合到宿主染色體中,因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù),產(chǎn)生高水平的表達(dá),但通常只持續(xù)幾天,多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說,超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高,在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)(依賴于各種不同的構(gòu)建)分析結(jié)果,常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白、β半乳糖苷酶等來幫助檢測(cè)。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,外源DNA既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體(episome)存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小。大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合,通常需要通過一些選擇性標(biāo)記,如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶(APH;新霉素抗性基因)、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)等反復(fù)篩選,得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。 |
轉(zhuǎn)染方法 | 原理 | 王要應(yīng)用 | 特點(diǎn) | |||||||||
DEAE-葡萄糖法 | 帶正電的DEAE-葡萄糖與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 | 相對(duì)簡(jiǎn)單、重復(fù)比磷酸鈣好,但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用,轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清且一般只用于BSC-1、CV-1、COS細(xì)胞系 | |||||||||
磷酸鈣法 | 磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,染瞬轉(zhuǎn)染 | 不適用于元代細(xì)胞(所需的DNA濃度較高),操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差,有些細(xì)胞不適用細(xì)胞建議用CSCL梯度離心,轉(zhuǎn)染拷貝數(shù)較多 | |||||||||
陽(yáng)離子脂質(zhì)體法 | 帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物,然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電核結(jié)合;另一種解釋是通過細(xì)胞時(shí)內(nèi)吞左右而被進(jìn)入細(xì)胞。(若DNA濃度過高,中和脂質(zhì)體表面電核,而降低了與細(xì)胞的結(jié)合能力) | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,所有細(xì)胞 | 使用方法簡(jiǎn)單,可攜帶大片段DNA,通用于各種類型的裸露DNA或RNA,能轉(zhuǎn)染各種類型的細(xì)胞,沒有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率,但在體內(nèi),能被血清清除,并在肺組織內(nèi)累積,誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng),導(dǎo)致高水平的毒性,這在很大程度上限制了其應(yīng)用 | |||||||||
陽(yáng)離子聚合物 | 帶正電的聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用,并通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,所有細(xì)胞 | 除了具有陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率高,操作簡(jiǎn)單,適用范圍廣,重復(fù)性好等特點(diǎn)外,還具有在體內(nèi),轉(zhuǎn)染效率高,細(xì)胞毒性低等特點(diǎn),是新一代的轉(zhuǎn)染試劑 | |||||||||
病毒介導(dǎo)法 | 逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA) | 通過病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用而進(jìn)入宿主細(xì)胞,之后反轉(zhuǎn)入酶啟動(dòng)合成DNA并隨機(jī)整合到宿主基因組中 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,特定宿主細(xì)胞 | 可用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞、原代細(xì)胞,體內(nèi)細(xì)胞等,但攜帶基因不能太大(<8kb),細(xì)胞需處分裂期,需考慮安全因素 | ||||||||
腺病毒(雙鏈DNA) | 先和細(xì)胞表面的受體結(jié)合,繼而在整合素介導(dǎo)下被細(xì)胞內(nèi)吞 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,特定宿主細(xì)胞 | 可用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞,需考慮安全因素 | |||||||||
Biolistic顆粒傳遞法(基因槍粒子轟擊法) | 將DNA用顯微鏡金屬顆粒沉淀,再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞,DNA在胞內(nèi)逐步釋放、表達(dá) | 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 | 可用于:人的表皮細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞 | |||||||||
顯微注射法 | 用顯微鏡操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 | 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限,多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞 | |||||||||
電穿孔法 | 高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位,DNA通過膜上形成小孔導(dǎo)入 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,所有細(xì)胞 | 適用性廣,除了質(zhì)粒外,還可轉(zhuǎn)染大的基因組(>65kb)但細(xì)胞致死率高, DNA和細(xì)飽用量大,需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件,拷貝數(shù)較少 1-20 |